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流式凋亡檢測

apoptosis detection

實驗原理

細胞凋亡(Cell apoptosis)是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用，它并不是病理條件下的損傷，而是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。

細胞凋亡檢測的方法很多，我們采用的Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡的原理：磷脂酰絲氨酸(Phosphatidyl serine, PS)正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行EGFP融合、熒光素(FITC、PE)或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針。(如下圖7.4所示）。

圖7.4 Annexinv檢測細胞凋亡的原理

碘化丙啶(Propidine lodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但可進入凋亡中晚期的細胞和死細胞，而使細胞核紅染。Annexin V/PI　雙染法檢測細胞凋亡，可以將凋亡早期的細胞和凋亡晚期以及死細胞區分開。

技術應用

細胞凋亡研究不僅受到基礎醫學界的重視,也日益受到臨床醫學領域的青睞。通過檢測藥物、基因或蛋白對細胞凋亡及凋亡調控基因的影響,在腫瘤防治、老年癡呆、艾滋病、自身免疫病,心肌梗塞等研究上都發揮著積極的作用。

實驗流程

實驗結果展示

圖1 采用流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡

TROUBLESHOOTING

常見問題FAQ

Q :常用的細胞凋亡的檢測種類有哪些?

A :凋亡檢測方法有數十種之多,主要可以分為以下幾大類: 1) DNA水平,檢測凋亡時基因組DNA的變化; 2)蛋白水平,主要檢測凋亡時線粒體和死亡受體兩大凋亡通路的變化; 3)細胞膜/細胞器膜水平,主要檢測凋亡時細胞膜成分或者膜電位的變化; 4)超微結構,主要檢測凋亡時亞細胞結構的變化。這些方法各有優缺點,必須結合具體的實驗目的,實驗條件以及實驗處理來選擇合適的分析手段。

Q :常見的細胞凋亡檢測方法及優缺點比較?

Q: Annexin V/PI雙染實驗的四個象限分別代表什么?

A:根據費光情況劃分四個象限(見圖7.6) ,橫坐標代表綠色熒光(Annexin V為FITC綠色熒光標記),縱坐標代表Pl紅色熒光,四個象限分別命名為LL, LR, UR, UL,由于Pl不能穿過未凋亡細胞和凋亡早期細胞的細胞膜,而Annexin V可以檢測到凋亡早期外翻的PS,因此四個象限代表了不同的細胞群。

圖7.6流式四象限圖

Q:流式上機檢測細胞凋亡每次所需要的細胞量大概是多少?

A:靶細胞接種到6孔板中進行前期藥物處理/轉染/感染后備用。對于個體比較大的細胞,依據實際細胞密度,使用150pxt培養血培養細胞,最終進行檢測需要10^5-10^6個細胞。

參考文獻

1. Vermes I, C, Steffens-Nakken H,et al. A novel assay for apoptosis. FIow cytometric detection ofphosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods 1995,184(1):39-51.

2. K o o pman G, Reutelingsperger CP, Kuijten GA, et al . Annexin V for flow cytometric of phosphatidylserineexpression on B cells undergoing apoptosis. BIood 1994, 84(5):1415-1420.