銳賽生物

甲基化檢測

Methylation detection

實驗原理

DNA甲基化存在于大多數真核生物中，一般發生在CpG雙核苷酸中胞嘧啶的5’UTR區，起調控作用。CpG的胞嘧啶大概有80%被甲基化，20%處于基因調控區的CpG島中。BSP甲基化測序（Bisulfite Genomic Sequencing PCR）的原理通過對基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理，非甲基化的胞嘧啶被脫氨基而轉變成尿嘧啶，在隨后的PCR反應中尿嘧啶轉變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被脫氨基，在反應完成時被保留（見圖5.1），我們將擴增得到的PCR產物進行TA克隆測序，就可以分析甲基化發生的具體情況。該方法實驗結果準確性高，是甲基化檢測的金標準。

圖5.1BSP甲基化檢測示意圖

技術應用

通過對疾病及正常對照樣本的靶基因進行甲基化分析，在研究腫瘤發生機制及早期診斷等方面均具有重要的臨床意義。

實驗流程

實驗結果展示

　　　　　　　　　　　　圖5.2待分析的目標片段PCR擴增電泳圖                       圖5.3菌落PCR篩選陽性克隆

圖5.4三樣本的甲基化結果圈點圖分析

注：圖中有三個樣本，每個樣本含5個克隆測序結果，共計15個測序結果。每個圓圈代表一個CG位點，黑圈代表甲基化，白圈代表未甲基化；每一行代表一個樣本TA克隆的一個測序結果，序列中所有的CG位點情況可被被羅列，此例序列中共含有31個CG位點。

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常用問題 FAQ

Q：常見的甲基化測定方法有哪些，優缺點是什么？

Q：BSP甲基化檢測的關鍵步驟有哪些？

A：1）基因組DNA的重亞硫酸鹽修飾：轉化效率高低直接影響實驗結果，所以需在實驗過程中不斷摸索合適的實驗條件以確保較高的轉化效率；

2）BSP引物設計：我們對每個區段設計一到兩對引物，引物位置需盡可能的避開DNA中的CG位點，必要時需設計巢式引物，以擴增得到目標片段;

3)PCR擴增：對于較難擴增得到的目標片段，需調整PCR反應條件。

Q：為什么800bp的目標片段要分成2段進行BSP甲基化研究？

A：由于基因組DNA被中亞硫酸鹽修飾后會發生斷裂，平均片段大小在500bp左右，所以每次擴增片段大小不能超過500bp。

Q：客戶問：BSP甲基化擴增得到的PCR產物可否直接測序，為什么需要構建TA克隆后測序？

A：由于基因組DNA的每個CG位點甲基化程度各不相同，C若未發生甲基化后會修飾成為U，而C若發生甲基化則不變，如果進行PCR產物測序就有可能在原有的C位點得到雙峰圖，無法確定甲基化的程度，必需通過回收PCR產物，進行TA克隆，隨機挑選5-10個單克隆測序的方式才能計算獲得每個CG位點的甲基化程度。

Q：如何對BSP甲基化測序結果進行分析？

A：我們會采用專業甲基化分析軟件對各個TA克隆的測序結果進行分析，分析過程中可以了解到：

1) 測序序列與目的序列的相似度；

2) C-T轉化效率；

3) 通過黑白圈點圖確認目的片段中每個CG是否發生甲基化；

4) 確認每個CG位點發生甲基化的比例。

Q ：怎樣確定基因的目標區域來進行甲基化分析呢？

A：BSP法甲基化檢測首先需要確定甲基化的檢測區域，由于甲基化與調控密切相關，因此我們可參考相關文獻對已知轉錄調控區的基因進行甲基化分析。如果轉錄調控區位置未知，可以通過基因組序列分析確定該基因的轉錄起始位點、翻譯起始密碼位置，并分析CpG島。轉錄起始位點附近的CpG島進行DNA甲基化分析的首選區域，一般位于啟動子或者5‘UTR區。需要說明的是，預測僅僅是找到可能性大的區域，我們不能保證預測出來得到區域肯定是有甲基化的。

Q：為什么文獻報導的甲基化序列不在CpG島中？

A：CG二核苷酸是發生甲基化位點的主要區域，而CG富含區更是甲基化發生幾率更高的區域，但是沒有明顯的CpG島不代表就沒有甲基化，甲基化也可能發生在并不密集的CG區域。

參考文獻

1. Li LC. Designing PCR primer for DNA methylation mapping. Methods Mol Biol 2007, 402:371-84.

2.Zhang Y, Rohde C,Tierling S, et al.DNA methylation analysis by bisulfite conversion,cloning, and sequencing of individual clones. Methods Mol Biol. 2009,507:177-87.