銳賽生物

酶聯免疫吸附測定

ELISA

實驗原理

酶聯免疫吸附劑測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的實驗技術?；驹硎牵?）使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。2）使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。由于酶的催化頻率很高，故可放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應，再用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應底物后，底物被酶催化為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據反應后顏色的深淺進行定性或定量分析（見圖4.7）。

圖4.7 ELISA檢測原理示意圖

實驗流程

實驗結果展示

Conecntrations

圖4.8ELISA標準曲線

表4.1五組樣本目的蛋白ELISA吸光度值及濃度

TROUBLESHOOTING

常見問題FAQ

Q：ELISA 試 劑 盒 主 要 有 哪 些 試 劑 ？

A：ELISA 試劑盒中主要有

1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；

2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；

3）酶的底物；

4）標準品；

5）結合物及標本的稀釋液；

6）洗滌液；

7）酶反應終止液。

Q：造成ELISA實驗結果不正常的因素有哪些？

A：造成ELISA測定結果不正常的因素主要有：

1）標本因素：樣本需新鮮采集，防止污染，且準確稀釋至適當的倍數。

2）試劑因素：ELISA試劑盒在保質期內，其他試劑如蒸餾水的水質等。

3）操作因素：注意操作細節，如加樣不可太快，避免加在孔壁上；洗板過程中注意洗液不能溢出孔外；顯色要注意控制時間等。

Q：如何準備需要進行ELISA檢測的細胞樣本？

A：檢測細胞分泌性成份時：用無菌管收集細胞培養上清，離心20分鐘（2000-3000轉/ 分）

取上清檢測。檢測細胞內成份時：收集細胞，用PBS（pH7.2-7.4）稀釋細胞濃度至 106/ml左右，通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑，使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分鐘（2000-3000 轉 / 分），收集上清。保存過程中如有沉淀形成，需再次離心。

Q：ELISA 試劑盒（96 孔規格）一般可以進行多少個樣本的檢測？

A：標準品孔和待測樣本孔需進行復孔操作以保證數據的可信度。每次需將標準品按照7-8個梯度稀釋以制備準確的標準曲線。一次96孔板實驗可以進行20-25個樣本的檢測工作。

Q：ELISA 的檢測數據如何進行處理？

A：1）將得到的各個復孔濃度的吸光度值計算平均值。

2）按照橫坐標為梯度稀釋的標準品濃度，縱坐標為吸光度值做散點圖，添加趨勢線，利用多項式回歸分析計算由以上數據產生的公式與 R2 值（R2 值越接近1說明線性關系越好）。

3）根據公式及待測樣本的平均吸光度值計算樣本中目的蛋白的濃度。

Q：常用的免疫學檢測方法ELISA和WB的區分有哪些？

參考文獻

1. J.R. Crowther. The ELISA Guidebook. Hunana Preaa,2001.

2. J.R. Crowther. ELISA:Theory and Practice.Humana Press,1995.